अनुक्रमण डीएनए के लिए तकनीक

जैव प्रौद्योगिकी का क्षेत्र लगातार परिवर्तन में से एक है। अत्याधुनिक शोध का तेजी से विकास और विकास, वैज्ञानिकों की नवाचार और रचनात्मकता और मूल आणविक तकनीक की क्षमता को देखने की उनकी क्षमता और नई प्रक्रियाओं पर इसे लागू करने पर निर्भर हैं। पीसीआर के आगमन ने डीएनए विश्लेषण के साधनों और उनके डीएनए दृश्यों के आधार पर अलग-अलग जीनों की पहचान सहित आनुवंशिक अनुसंधान के कई दरवाजे खोल दिए।

डीएनए अनुक्रमण भी डीएनए के अलग-अलग किस्मों को अलग करने के लिए जेल वैद्युतकणसंचलन का उपयोग करने की हमारी क्षमता पर निर्भर है जो एक आधार जोड़ी के रूप में छोटे आकार में भिन्न है।

डीएनए अनुक्रमण देर से 1 9 70 के दशक में डीएनए अणुओं के दो डीएनए अनुक्रमण तकनीकों का आविष्कार किया गया। ये

सेंगर (या डीडीओडीओ) विधि और मैक्सम-गिल्बर्ट (रासायनिक क्लेविज) विधि थे। मैक्सम-गिलबर्ट विधि रसायनों द्वारा न्यूक्लियोटाइड-विशिष्ट दरार पर आधारित है और ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स (लघु न्यूक्लियोटाइड पॉलिमर, आमतौर पर लंबाई में 50 आधार-जोड़े से छोटा) अनुक्रम के लिए सबसे अच्छा उपयोग किया जाता है। सेंगर विधि का अधिक सामान्यतः प्रयोग किया जाता है क्योंकि यह तकनीकी रूप से लागू करने में आसान साबित हुआ है, और, पीसीआर और तकनीक के स्वचालन के आगमन के साथ आसानी से डीएनए के लंबे समय के किनारों पर लागू किया जाता है जिसमें कुछ पूरे जीन शामिल होते हैं। यह तकनीक पीसीआर बढ़ाव प्रतिक्रियाओं के दौरान डायडऑक्सीनक्लियोटाइड्स द्वारा श्रृंखला समाप्ति पर आधारित है।

सेंगर विधि

सेंगर विधि में, डीएनए स्ट्रैंड का विश्लेषण किया जाना एक टेम्प्लेट के रूप में प्रयोग किया जाता है और पीएनआर प्रतिक्रिया में डीएनए पोलीमरेज़ का प्रयोग किया जाता है, प्राइमरों के उपयोग से मानार्थ किस्में उत्पन्न करने के लिए।

चार अलग-अलग पीसीआर रिएक्शन मिश्रण तैयार किए गए हैं, इनमें से प्रत्येक में चार न्यूक्लियोटाइड्स (एटीपी, सीटीपी, जीटीपी या टीटीपी) में से एक में डीडोऑक्सीनक्ल्यूसाइड त्रिफॉस्फेट (डीडीएनटीपी) एनालॉग का एक निश्चित प्रतिशत है। जब तक इन एनालॉग में शामिल नहीं किया जाता है तब तक नए डीएनए किनारा का संश्लेषण जारी रहता है, उस समय किनारा समय से पहले काट दिया जाता है।

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प्रत्येक पीसीआर प्रतिक्रिया में डीएनए किस्में की अलग-अलग लंबाई का मिश्रण होता है, जो कि न्यूक्लियोटाइड के साथ समाप्त होता है, जो उस प्रतिक्रिया के लिए लेबल किया गया था। जेल वैद्युतकणसंचिकरण तब चार अलग-अलग गलियों में चार प्रतिक्रियाओं की किस्में अलग करने के लिए उपयोग किया जाता है, और मूल टेम्पलेट के अनुक्रम को निर्धारित करता है जो कि न्यूक्लियोटाइड के साथ किनों की लंबाई का अंत होता है।

स्वचालित सेंगर प्रतिक्रिया में, प्राइमरों का प्रयोग किया जाता है जो चार अलग-अलग रंग के फ्लोरोसेंट टैग के साथ लेबल किए जाते हैं। पीसीआर प्रतिक्रियाओं, विभिन्न डीडीओसी न्यूक्लियोटाइड की उपस्थिति में, उपर्युक्त वर्णित के अनुसार किया जाता है। हालांकि, अगले, चार प्रतिक्रिया मिश्रित तो संयुक्त होते हैं और एक जेल के एक लेन पर लागू होते हैं। लेजर बीम का उपयोग करके प्रत्येक टुकड़ा का रंग पता लगाया जाता है और सूचना कंप्यूटर द्वारा एकत्र की जाती है जो प्रत्येक रंग के लिए चोटियों को दिखाने वाले क्रोमैमैट्रोग्राम उत्पन्न करता है, जिससे टेम्प्लेट डीएनए अनुक्रम निर्धारित किया जा सकता है।

आमतौर पर, स्वचालित अनुक्रमण पद्धति केवल अधिकतम लंबाई के लगभग 700-800 आधार-जोड़े तक दृश्यों के लिए सटीक होती है। हालांकि, बड़े जीनों की पूर्ण अनुक्रम प्राप्त करना संभव है, और वास्तव में, पूरे जीनोम, प्राइमर वाइकिंग और शॉटगन अनुक्रमण जैसी चरण-वार तरीकों का उपयोग कर।

प्राइमर वॉकिंग में, एक बड़े जीन का एक व्यावहारिक हिस्सा सेंगर विधि का उपयोग करके अनुक्रमित किया गया है। नए प्राइमरों को अनुक्रम के किसी विश्वसनीय सेगमेंट से उत्पन्न किया जाता है और मूल प्रतिक्रियाओं की सीमा से बाहर होने वाले जीन के हिस्से को क्रमबद्ध करने के लिए उपयोग किया जाता था। शॉटगन अनुक्रमण अनियमित रूप से डीएनए सेगमेंट को अधिक उपयुक्त (प्रबंधनीय) आकार के टुकड़ों में कटौती, प्रत्येक टुकड़ा अनुक्रमण, और ओवरलैपिंग अनुक्रमों के आधार पर टुकड़ों को व्यवस्थित करने पर जोर देता है। ओवरलैपिंग टुकड़ों को व्यवस्थित करने के लिए इस तकनीक को कंप्यूटर सॉफ़्टवेयर के आवेदन से आसान बना दिया गया है।