प्रोटीन शुद्धि के लिए विधियां

जैव प्रौद्योगिकी अनुसंधान का एक महत्वपूर्ण हिस्सा विशिष्ट औद्योगिक अनुप्रयोगों के लिए अनुकूलित गुणों के साथ प्रोटीन को डिजाइन या संशोधित करने के लिए प्रोटीन इंजीनियरिंग तकनीकों का उपयोग करना है। ऐसा करने के लिए इस वैज्ञानिक को ब्याज की प्रोटीन को अलग और शुद्ध करने में सक्षम होना चाहिए ताकि उनके अनुरूप, सब्सट्रेट विशिष्टता, अन्य लिगैंड के साथ प्रतिक्रियाएं और विशिष्ट गतिविधियों का अध्ययन किया जा सके।

प्रोटीन की शुद्धता की मात्रा प्रोटीन के अंतिम उद्देश्य पर निर्भर करती है

कुछ अनुप्रयोगों के लिए, एक कच्चे अर्क पर्याप्त है हालांकि, अन्य उपयोगों, जैसे कि खाद्य पदार्थों और फार्मास्यूटिकल्स में, उच्च स्तर की शुद्धता के लिए आवश्यक है इन प्रोटीन शुद्धि के तरीकों को प्राप्त करने के लिए आमतौर पर शुद्धि चरणों की श्रृंखला में उपयोग किया जाता है।

प्रत्येक प्रोटीन शुद्धि चरण आम तौर पर कुछ हद तक उत्पाद के नुकसान में होता है इसलिए, एक आदर्श प्रोटीन शुद्धि की रणनीति एक है जिसमें उच्चतम स्तर की शुद्धि कुछ ही चरणों में पहुंची है। किस चरण का चयन करना, आकार, चार्ज, विलेयता और लक्ष्य प्रोटीन के अन्य गुणों पर निर्भर है। निम्नलिखित तकनीक एक एकल साइटोसोलिक प्रोटीन को शुद्ध करने के लिए सबसे उपयुक्त हैं साइटोसोलिक प्रोटीन परिसरों की शुद्धता अधिक जटिल है और आम तौर पर विभिन्न तरीकों को लागू करने की आवश्यकता होती है।

प्रोटीन शुद्धि के लिए पहला कदम

शुद्ध करने में पहला कदम इंट्रासेल्युलर (सेल के अंदर) प्रोटीन एक कच्चे तेल निकालने की तैयारी है निकालने में कोशिका कोशिकाप्लेमा से सभी प्रोटीन का एक जटिल मिश्रण होगा, और कुछ अतिरिक्त अणुओं, कोशिकाओं, और पोषक तत्व। क्रूड निकालने का इस्तेमाल जैव प्रौद्योगिकी में कुछ अनुप्रयोगों के लिए किया जा सकता है, हालांकि, यदि शुद्धता एक मुद्दा है, तो बाद के शुद्धि चरण का पालन किया जाना चाहिए। कच्चे प्रोटीन का अर्क कोशिका विश्लेषण द्वारा उत्पन्न सेलुलर मलबे को हटाने के द्वारा तैयार किया जाता है, जो रसायनों और एंजाइमों, सोनिकेशन या फ्रांसीसी प्रेस से प्राप्त होता है।

मलबे को सेंट्रीफ्यूगेशन द्वारा हटा दिया गया है, और सतह पर तैरनेवाला ठीक हो गया है। केन्द्रापसारक द्वारा कोशिकाओं को निकालने के द्वारा बाह्य प्रोटीन की क्रूड तैयारियां प्राप्त की जा सकती हैं।

कुछ जैव प्रौद्योगिकी अनुप्रयोगों के लिए,

थर्मोस्टेबल एंजाइमों

की मांग है: एंजाइम्स जो बिना तापमान के उच्च तापमान को बर्दाश्त कर सकते हैं, और एक उच्च विशिष्ट गतिविधि को बनाए रखते हुए जीवों कि उन्हें उत्पादन कभी कभी extremophiles कहा जाता है गर्मी प्रतिरोधी प्रोटीन शुद्ध करने के लिए एक आसान तरीका यह है कि मिश्रण में अन्य प्रोटीन को गर्म करके, फिर समाधान को ठंडा करना (इस प्रकार थर्मोस्टेबल एंजाइम को यदि आवश्यक हो तो सुधार या पुन: विघटन करने की इजाजत देता है। विकृत प्रोटीन को तब सेंटीफ्यूजेशन द्वारा हटाया जा सकता है। मध्यवर्ती शुद्धिकरण कदम अतीत में, एक कच्चे तेल निकालने से एक प्रोटीन को शुद्ध करने के लिए एक सामान्य दूसरा कदम वर्षा उच्च आसमाटिक शक्ति (i।ई। नमक समाधान)। क्रूड निकालने में न्यूक्लिक एसिड स्ट्रेप्टोमाइसिन सल्फेट या प्रोटेमाइन सल्फेट के साथ गठित समुच्चय को हटाकर हटाया जा सकता है। प्रोटीन वर्षा आमतौर पर नमक के रूप में अमोनियम सल्फेट का उपयोग किया जाता है।

विभिन्न प्रोटीन

अमोनियम सल्फेट के विभिन्न सांद्रणों में वेग होगा आम तौर पर, अमोनियम सल्फेट के कम सांद्रता में उच्च आणविक वजन की प्रोटीन कम होती है। नमक की कमी आमतौर पर अत्यधिक शुद्ध प्रोटीन के लिए नहीं लेती है लेकिन मिश्रण में कुछ अवांछित प्रोटीनों को नष्ट करने और नमूना को ध्यान में रखकर सहायता कर सकती है। समाधान में नमक को छिद्रपूर्ण सेल्युलोज टयूबिंग, निस्पंदन या जेल बहिष्कार क्रोमैटोग्राफी के माध्यम से डायलिसिस द्वारा हटा दिया जाता है।

आधुनिक बायोटेक प्रोटोकॉल कई व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किटों का लाभ उठाते हैं जो मानक प्रक्रियाओं के लिए तैयार किए गए समाधान प्रदान करते हैं। प्रोटीन शुद्धि अक्सर फिल्टर और तैयार जेल निस्पंदन स्तंभों का उपयोग करके किया जाता है। आपको केवल निर्देशों का पालन करना है और सही समाधान के सही मात्रा को जोड़ना और एक निश्चित टेस्ट ट्यूब में एलुअंट (जो कॉलम के दूसरे छोर से बाहर आता है) को एकत्र करते हुए समय की निर्दिष्ट लंबाई का इंतजार करना चाहिए। क्रोमेटोग्राफिक पद्धतियों को बेंच-टॉप कॉलम या स्वचालित एचपीएलसी उपकरण का उपयोग कर लागू किया जा सकता है। एचपीएलसी द्वारा पृथक्करण रिवर्स-चरण, आयन-एक्सचेंज या साइज-अपवर्जन विधियों और डायोड एरे या लेजर टेक्नोलॉजी द्वारा पता लगाया जा सकता है। प्रोटीन विज़ुअलाइज़ेशन और शुद्धिकरण का मूल्यांकन

रिवर्स-चरण क्रोमैटोग्राफी

(आरपीसी) प्रोटीन को उनके रिश्तेदार

• हाइड्रोफोबिबिकीस

  पर आधारित करता है। यह तकनीक अत्यधिक चयनात्मक है लेकिन जैविक सॉल्वैंट्स के उपयोग की आवश्यकता है। कुछ प्रोटीन सॉल्वैंट्स द्वारा स्थायी रूप से विकृत होते हैं और RPC के दौरान कार्यक्षमता खो देंगे। इसलिए इस विधि को सभी अनुप्रयोगों के लिए अनुशंसित नहीं किया जाता है, खासकर यदि गतिविधि के लिए लक्ष्य प्रोटीन बनाए रखने के लिए आवश्यक हो।

  • आयन-एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी का अर्थ है प्रभार के आधार पर प्रोटीन को अलग करना। कॉलम या तो आयन एक्सचेंज या सीशन एक्सचेंज के लिए तैयार किए जा सकते हैं।
  • आयन एक्सचेंज कॉलम में एक सकारात्मक चरण होता है जो नकारात्मक चार्ज प्रोटीन को आकर्षित करता है। केशन एक्सचेंज कॉलम रिवर्स हैं, नकारात्मक रूप से चार्ज किए गए मोती जो सकारात्मक रूप से चार्ज प्रोटीन को आकर्षित करते हैं लक्ष्य प्रोटीन (ए) का अघुलनशील स्तंभ में पीएच को बदलकर किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप प्रत्येक प्रोटीन के चार्ज किए गए कार्यात्मक समूहों में बदलाव या निष्क्रियता होती है। आकार-अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी ( जेल निस्पंदन ) छोटे से बड़े प्रोटीन को अलग करती है क्योंकि बड़े अणु क्रोमैटोग्राफी स्तंभ में क्रॉस-लिंक किए गए पॉलिमर के माध्यम से तेज़ी से यात्रा करते हैं। बड़े प्रोटीन बहुलक के छिलकों में फिट नहीं होते हैं जबकि छोटे प्रोटीन करते हैं, और क्रोमैटोग्राफी कॉलम के माध्यम से यात्रा करने के लिए उनके कम प्रत्यक्ष मार्ग के माध्यम से अधिक समय लेते हैं। एल्यूएट को ल्यूकेशन टाइम पर आधारित प्रोटीन को अलग करने वाली ट्यूबों की एक श्रृंखला में एकत्र किया जाता है। जेल छानने का काम एक प्रोटीन नमूना को ध्यान में रखने के लिए एक उपयोगी उपकरण है क्योंकि लक्ष्य प्रोटीन को छोटे एल्यूभन मात्रा में एकत्र किया जाता है, जो शुरू में कॉलम में जोड़ा गया था।उनकी लागत-प्रभावशीलता के कारण बड़े पैमाने पर प्रोटीन उत्पादन के दौरान इसी प्रकार की निस्पंदन तकनीक का उपयोग किया जा सकता है। एफ़िनिटी क्रोमैटोग्राफी प्रोटीन शुद्धि प्रक्रिया को "चमकाने" या पूरा करने के लिए एक बहुत उपयोगी तकनीक है। क्रोमैटोग्राफी कॉलम में मोती लिगैंड से जुड़ा हुआ है जो विशेष रूप से लक्षित प्रोटीन के साथ बाँधते हैं। प्रोटीन को तब स्तंभ से हटा दिया जाता है जिसमें मुक्त लिगैंड युक्त समाधान होता है। यह पद्धति अन्य तकनीकों की तुलना में शुद्धतम परिणाम और सर्वोच्च विशिष्ट गतिविधि देती है। एसडीएस पृष्ठ
  • पॉलीएक्लाइमाइड जेल वैद्युतकणसंचलन है, जो एसडीएस (सोडियम डाोडेसिकल सल्फेट) की उपस्थिति में किया जाता है जो प्रोटीन को एक बड़ी शुद्ध नकारात्मक चार्ज देते हैं। चूंकि सभी प्रोटीन के प्रभार काफी बराबर हैं, इसलिए यह विधि उन्हें पूरी तरह से आकार के आधार पर अलग करती है। एसडीएस पृष्ठ अक्सर श्रृंखला में प्रत्येक चरण के बाद प्रोटीन की शुद्धता का परीक्षण करने के लिए उपयोग किया जाता है। चूंकि अवांछित प्रोटीन को धीरे-धीरे मिश्रण से निकाल दिया जाता है, एसडीएस-पेज जेल पर देखने वाले बैंड की संख्या कम हो जाती है, जब तक कि वांछित प्रोटीन का प्रतिनिधित्व करने वाला एक बैंड ही नहीं होता है। Immunoblotting एक प्रोटीन विज़ुअलाइजेशन तकनीक है जो आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी के साथ संयोजन में लागू होती है। विशिष्ट प्रोटीन के लिए एंटीबॉडी एक आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी स्तंभ पर लिगैंड के रूप में उपयोग किया जाता है। लक्ष्य प्रोटीन को स्तंभ पर रखा जाता है, फिर एक नमक समाधान या अन्य एजेंटों के साथ कॉलम को धोया जाता है। लक्ष्यीकरण प्रोटीन का पता लगाने में रेडियोधर्मी या डाई लेबल्स सहायता से जुड़े एंटीबॉडीज को शेष मिश्रण से अलग किया जाता है।
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