पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन जीन बढ़ाने के लिए कैसे काम करता है

पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) एक आणविक आनुवंशिक तकनीक है जो कि एक जीन की कई प्रतियां बनाती है और यह जीन अनुक्रमण प्रक्रिया का भी हिस्सा है।

पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन काम कैसे करता है?

जीन की प्रतियां डीएनए के एक नमूने का उपयोग करके बनाई जाती हैं, और तकनीक नमूने में पाए जाने वाले जीन की एक ही प्रति से कई प्रतियां बनाने के लिए पर्याप्त है। लाखों प्रतियां बनाने के लिए जीन के पीसीआर प्रवर्धन, डीएनए के टुकड़े के आकार और प्रभार (+ या -) के आधार पर विजुअल तकनीक का उपयोग करके जीन अनुक्रमों का पता लगाने और पहचान करने की अनुमति देता है।

नियंत्रित परिस्थितियों में, डीएनए के छोटे से हिस्से डीएनए पॉलीमरिस के रूप में जाना जाने वाले एंजाइम द्वारा उत्पन्न होते हैं, जो कि "टेम्पलेट" के रूप में जाना जाता डीएनए के एक टुकड़े के लिए मानार्थ डीओक्सिनक्लियोक्लाइड (डीएनटीपी) को जोड़ते हैं। डीएनए के भी छोटे टुकड़े, जिन्हें "प्राइमरों" कहा जाता है, को पोलीमरेज़ के शुरुआती बिंदु के रूप में उपयोग किया जाता है। प्राइमर छोटे डीएनए (ऑलिगोमर्स) के मानव निर्मित टुकड़े होते हैं, आमतौर पर 15 से 30 न्यूक्लियोटाइड के बीच होते हैं। इन्हें बढ़ाया जा रहा जीन के बहुत सिरों पर छोटे डीएनए अनुक्रमों को जानने या अनुमान लगाने से बनाया जाता है। पीसीआर के दौरान, अनुक्रमित डीएनए को गरम किया जाता है और डबल किस्में अलग होती हैं। ठंडा करने पर, प्राइमरों टेम्पलेट (एनीलिंग) कहा जाता है और शुरू करने के लिए पोलीमरेज़ के लिए एक जगह बनाते हैं।

पीसीआर तकनीक पॉलिमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) थर्मोफिल और थर्मोफिलिक पोलीमरेज़ एंजाइम (उच्च तापमान पर हीटिंग के बाद संरचनात्मक अखंडता और कार्यक्षमता बनाए रखने वाले एंजाइम) की खोज के द्वारा संभव हो गया था।

पीसीआर तकनीक में शामिल कदम निम्नानुसार हैं:

डीएनए टेम्पलेट, पोलीमरेज़ एंजाइम, प्राइमरों, और डीएनटीपी की अनुकूलित सांद्रता के साथ एक मिश्रण बनाया गया है। एंजाइम को denaturing बिना मिश्रण गर्मी करने की क्षमता से 94 डिग्री सेल्सियस की सीमा में तापमान पर डीएनए नमूने के दोहरी हेलिक्स को denaturing के लिए अनुमति देता है।

निषेध के बाद, नमूना लगभग 54 डिग्री तक एक अधिक मध्यम सीमा तक ठंडा है, जो एकल-फंसे डीएनए टेम्पलेट्स के लिए प्राइमरों के एनेलिंग (बाध्यकारी) की सुविधा देता है।

• चक्र के तीसरे चरण में, नमूना को 72 डिग्री तक बढ़ाया जाता है, विस्तार के लिए Taq डीएनए पोलीमरेज़ के लिए आदर्श तापमान। विस्तार के दौरान, डीएनए पोलीमरेज़ प्रत्येक प्राइमर के 3 'सिरों को पूरक डीएनटीपी को जोड़ने के लिए एक टेम्पलेट के रूप में डीएनए की मूल एकल कब्र का उपयोग करता है और ब्याज के जीन के क्षेत्र में डबल-फंसे डीएनए का एक खंड उत्पन्न करता है।
• प्राइमर्स जिन्होंने डीएनए अनुक्रमों को जोड़ लिया है, जो सटीक नहीं हैं, वे 72 डिग्री पर एकमात्र नहीं रहे हैं, इस प्रकार ब्याज की जीन के विस्तार को सीमित करता है।
• denaturing, annealing और बढ़ाव की इस प्रक्रिया को कई बार (30-40) बार दोहराया जाता है, जिससे मिश्रण में वांछित जीन की प्रतियां की संख्या में तेजी से वृद्धि हो जाती है।यद्यपि यह प्रक्रिया बहुत कठिन हो सकती है यदि मैन्युअल रूप से प्रदर्शन किया जाता है, तो अब बहुआयामी आणविक प्रयोगशालाओं में एक प्रोग्रामयोग्य थर्मोस्कीक्लर में नमूनों को तैयार किया जा सकता है और इनके सेवन किया जा सकता है, और एक पूरी पीसीआर प्रतिक्रिया 3-4 घंटे में की जा सकती है।

प्रत्येक denaturing चरण पिछले चक्र की बढ़ाव प्रक्रिया रोकता है, इस प्रकार डीएनए की नई किनारा को तोड़ने और वांछित जीन के लगभग आकार के लिए इसे रखने

बढ़ाव चक्र की अवधि ब्याज के जीन के आकार के आधार पर लंबे या कम किया जा सकता है, लेकिन अंततः, पीसीआर के दोहराए गए चक्रों के माध्यम से, अधिकांश टेम्पलेट अकेले ब्याज के जीन के आकार के लिए सीमित होंगे , क्योंकि वे प्राइमरों दोनों के उत्पादों से उत्पन्न हो चुके होंगे।

सफल पीसीआर के लिए कई अलग-अलग कारक हैं जो परिणामों को बढ़ाने के लिए हेरफेर किया जा सकता है पीसीआर उत्पाद की उपस्थिति के लिए परीक्षण करने के लिए सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जाने वाला तरीका agarose जेल वैद्युतकणसंचलन है। आकार और चार्ज के आधार पर डीएनए टुकड़ों को अलग करने के लिए इसका उपयोग किया जाता है। टुकड़ों को फिर रंग या रेडियोसोटोपों का उपयोग करके देखा जाता है।

उत्क्रांति पीसीआर की खोज के बाद से, मूल ताक के अलावा डीएनए पोलीमरेज़ की खोज की गई है। इनमें से कुछ बेहतर "प्रूफरीडिंग" क्षमता या उच्च तापमान पर अधिक स्थिर हैं, इस प्रकार पीसीआर की विशिष्टता में सुधार और ग़लत डीएनटीपी को डालने से त्रुटियों को कम करना

पीसीआर के कुछ बदलाव विशिष्ट अनुप्रयोगों के लिए डिज़ाइन किए गए हैं और अब आणविक आनुवंशिक प्रयोगशालाओं में नियमित रूप से उपयोग किया जाता है। इनमें से कुछ रीयल-टाइम पीसीआर और रिवर्स-ट्रांस्क्रिप्टेज़ पीसीआर हैं। पीसीआर की खोज ने डीएनए अनुक्रमण, डीएनए फिंगरप्रिंटिंग और अन्य आणविक तकनीकों के विकास के लिए भी नेतृत्व किया है।